Рестрикционные ферменты представляют собой ферменты, которые режут как одно-, так и двухцепочечную ДНК. Каждый рестрикционный фермент имеет специфическую нуклеотидную последовательность, называемую сайтом рестрикции, которую он распознает и режет. Рестрикционные ферменты используются для секвенирования ДНК, мутационного анализа, клонирования и амплификации ДНК. Ученые используют рестрикционные ферменты, чтобы вставлять интересующие гены в векторы экспрессии, молекулы ДНК, которые могут реплицироваться отдельно от хромосомной ДНК. Вектор, содержащий интересующий ген, затем может быть введен в бактериальный штамм для экспрессии и характеристики белков.
Видео дня
Шаг 1
Определите сайты рестрикционных ферментов на вашем векторе, просмотрев карту ограничений. Карта ограничений скажет вам, какие ферменты будут вырезать ваш вектор, и где.
Шаг 2
Выберите рестрикционный фермент, который также имеет сайт, присутствующий на вашей вставке гена, просмотрев последовательность вставки. Убедитесь, что сайт ограничения находится в позиции на вашей вставке, которая находится за пределами интересующего гена, поэтому вы не теряете какую-либо часть гена.
Шаг 3
Убедитесь, что в репозиционном сайте нет дубликатов сайта, где бы вы ни находились. Это вызовет множественные сокращения в вашей ДНК и даст вам вводящие в заблуждение данные.
Шаг 4
Попробуйте выбрать рестрикционные ферменты, которые разрезаются липкими концами, а не тупыми концами. Липкие концы возникают, когда фермент разрезает двухцепочечную ДНК ступенчато, оставляя одиночный скрученный выступ, который облегчает прикрепление с вставкой, разрезанной противоположным образом. Тупые концы происходят, когда двухцепочечная ДНК разрезается гладко, и их сложнее прикрепить.
Шаг 5
Выберите другой рестрикционный фермент для обоих концов вашей вставки, чтобы убедиться, что он вставлен в вектор в правильной ориентации и чтобы вектор не повторно прикреплялся к себе.
Шаг 6
Попробуйте выбрать два рестрикционных фермента, которые хорошо функционируют в той же буферной системе и температуре. Если это невозможно, выполните каждое переваривание отдельно.
Вещи, которые вам понадобятся
- Последовательность вставки гена
- Карта ограничений для выбора вектора
- Список рестрикционных ферментов и их срезанных сайтов
Советы
- Некоторые веб-программы были разработаны для выявления сайты рестрикции на последовательности ДНК быстро. Одна такая программа из New England BioLabs.
